肺癌基因治疗方法

围绕肺癌基因治疗的目的，针对肺癌的发生、发展和转移等各个阶段以及治疗靶位的不同，基因疗法可以概括为以下几种类型：

一、阻碍原癌基因过量表达治疗

原癌基因的突变激活是肺癌发生的充分条件，原癌基因或其启动子的突变可导致原癌基因的高水平表达，最终导致肺癌细胞的永生化和恶性生长。针对原癌基因的异常活化，设计特异的反义RNA或 siRNA进行RNA干扰，可以有效地阻碍原癌基因的过量表达。目前常用的RNA干扰的靶基因包括：myc、neu、ras等。目前已报道，将抑制c-Myc基因的microRNA-45表达质粒转染至ras基因异常表达的NSCLC细胞中，可以抑制NSCLC细胞的生长;myc基因的反义RNA 体外实验可以抑制SCLC细胞的恶性生长。阻碍原癌基因的过量表达治疗，可以抑制肺癌的生长和转移，但却不能杀死肿瘤细胞。

二、补偿抑癌基因表达治疗

补偿抑癌基因表达治疗的方法，是利用分子生物学的技术，将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，替代原有的突变失活的抑癌基因，或者干扰因抑癌基因的突变造成的信号转导通路的失调，抑制肿瘤细胞的生长和转移，进而诱导肿瘤细胞凋亡。目前常用的抑癌基因包括： p53、p16、RB等;其中又以p53基因应用最广，目前已有针对NSCLC治疗携带p53基因的重组腺病毒载体的I期临床试验，相关的治疗效果和毒副作用需进一步的总结。P53基因过表达治疗主要针对p53基因缺陷的肿瘤细胞，而对无此突变的细胞无效。抑癌基因表达治疗配合放化疗，增强肿瘤细胞敏感性的联合治疗，目前已经进入临床试验阶段。

三、抗血管生成基因治疗

肺癌是血管依赖性肿瘤，肿瘤血管为肿瘤的生长提供氧气和养分的输送和代谢废物的输出，此外肿瘤血管通常缺乏平滑肌，基底膜有不规则的漏洞，有利于肿瘤的转移。抗血管生成基因治疗主要通过抑制肿瘤血管的生成，抑制肿瘤的生长和转移。目前抗血管生成基因治疗主要包括：针对VEGF及其受体(VEGFR)的基因治疗、血管抑素 (vasostatin)基因治疗、内皮抑素(endostatin)基因治疗。其中又以VEGF诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高，为抗血管生成基因治疗的首选。

四、自杀基因治疗

针对肿瘤治疗的自杀基因治疗方法，是通过将表达外源性酶活性的基因导入肿瘤细胞，随后在体内稳定表达的活性酶可以将肿瘤细胞周围的无毒性的药物(称为药物前体)催化成为仅对肿瘤细胞具有细胞毒性的药物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。由于在实际应用中，通常采用病毒载体，因此又被称为病毒介导的酶解药物前体疗法 (virus directed enzyme pro drug therapy, VDEPT) 。自杀基因治疗系统有数十种，其中在肺癌研究中运用最多的是胸腺嘧啶激酶基因/丙氧鸟苷系统(TK/GCV)和胞苷脱氨酶/氟胞嘧啶系统(CD/5-FC)。 除了针对肿瘤细胞进行治疗，目前已经出现应用TK/GCV系统且以肿瘤血管内皮细胞作为靶细胞进行治疗的尝试。但自杀基因治疗仅能杀伤S期细胞，自杀基因的靶向导入问题是该疗法的主要限制因素。

五.免疫基因治疗

肺癌细胞的免疫原性弱，一般不足以刺激免疫系统对其产生排斥反应。免疫基因治疗就是将特定外源基因转入肿瘤细胞中，使其高水平表达相关的细胞因子或MHC抗原，从而激化抗肿瘤的特异性免疫作用。使用遗传工程技术处理肿瘤细胞，使其携带特定细胞因子基因, 注射至机体后可以在肿瘤位点持续稳定的表达并释放所携带的细胞因子。注射活的携带特定细胞因子基因的肿瘤细胞，经过增殖会产生更多的抗原并提高细胞因子浓度，直到达到生物学和药理学所需的阈值，引起抗肿瘤的特异性免疫反应。随着免疫反应的进行，肿瘤细胞被杀死，从而关闭了初始的触发作用。目前研究常用的细胞因子包括:提高IL-2、INF-γ、 TNF-a等从而提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别作用，增强组织相容性抗原等位基因表达，诱导机体的免疫反应。

研究表明，45%- 75% NSCLC和70%以上SCLC中可探测基因突变，将外源野生型p53基因导入p53失活的肺癌细胞，可以对其进行遗传修饰，抑制其恶性增殖从而产生治疗效应。用腺病毒抗体将IL-24转染至肺癌细胞可以抑制肺癌细胞的增殖并可增强癌细胞对放疗的敏感性。将自杀基因导入肺癌细胞，通过表达，使前体活化，阻断癌细胞的核酸代谢，导致癌细胞的死亡。

肺癌的免疫治疗研究主要在主动免疫治疗方面，即通过给机体注射肿瘤特异性抗原或基因修饰的肿瘤细胞或树突状细胞，抗原信息经抗原递呈细胞至111细胞和细胞毒T细胞(CTL),致Th、CTL等细胞激活分泌大量的细胞因子，进而活化NK细胞及巨噬细胞发挥抗肿瘤作用。同时活化B细胞向浆细胞分化，产生大量针对肿瘤抗原的特异性抗体，发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。肺癌的免疫治疗从非特异性免疫刺激物如IL-2、胸腺肽、卡介苗等逐步发肿瘤特异性疫苗。一项II期临床试验，应用了携带GM-CSF腺病毒我体的自体肿瘤细胞疫苗，人组43例NSCLC患者，10例为早期，33例为晚期。结果显示3 例患者出现缓解期，亚组分析显示疫苗GM-CSF分泌量与患者生存率有关，初步显示免疫治疗肺癌的前景。

1 .补充免疫细胞因子疗法

细胞因子是由免疫活性细胞(淋巴细胞、单核-吞噬细胞等)和相关细胞(成纤维细胞、内皮细胞等)产生的具有生物活性的糖蛋白和肽类物质，常用于肺癌治疗的基因重组细胞因子有IFN-α、IL-22、 粒细胞集落刺激因子(G2CSF)、促细胞生成素(EPO)和血小板生成因子(TPO)等。IFN-α是最早发现的具有抗癌效应的细胞因子，在NSCLC的临床试验中显示出了良好的疗效，单独应用每日肌注3X106U,可达到9%的缓解率(PR)。2002年，一个包含714例SCLC患者长达20年的随机临床试验结果显示，与标准的单一放化疗相比，联合持续低剂量应用IFN-α,治疗组中位生存期有显著延长;同时还提示，其可能有放射增敏作用。G-CSF、EPO和TPO的应用，对于改 善传统放疗、化疗患者的白细胞减少、贫血及血小板减少、缓解相关临床症状、减少粒细胞缺乏性发热、出血等发挥了重要的作用。由于这三种细胞因子的保障，目前SCLC的大剂量化疗和造血干细胞移植得以广泛开展，使广泛期SCLC患者的5年生存率有所提高。

2 .输注免疫活性细胞过继免疫疗法

免疫活性细胞过继免疫疗法是指以输注自身或同种特异性或非特异性肿瘤杀伤细胞，来达到治疗肿瘤目的的治疗方法，它不仅可纠正细胞免疫功能低下，并且可直接补充免疫活性细胞数量，从而发挥抗肿瘤作用。输注的细胞主要包括淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)、细胞毒性T细胞、树突状细胞(DC)、基因改造的免疫活性细胞以及CIK细胞等。LAK和TIL细胞常用IL-2直接或间接激活并扩增，然后输注给患者，定期补充IL-2来维持它们的活性;CTL一般通过效应细胞与刺激细胞混合培养产生，效应细胞可以是患者的外周血、淋巴结、脾脏来源的淋巴细胞，也可以用TIL刺激细胞，可以是肿瘤细胞系或手术切除的肿瘤组织细胞。CIK细胞是一种新型的免疫活性细胞，它是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后，获得的一群异质细胞，具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。CD3+、CD56+T细胞是CIK群体中主要效应细胞。CIK细胞凭借其增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高的优势，已经成为了新一代肿瘤过继免疫疗法中的主要细胞。对其在基础及临床方面的研究正在不断深入，相信在不远的将来，CIK细胞在肿瘤生物治疗方面将会获得更大的应用。

3.p53基因

是人们用于基因治疗中最早选择的一种治疗基因，肺癌的基因治疗主要是采用野生型p53基因，通过与腺病毒而构建成Ad-53;然而采用瘤体内直接注射，以使肿瘤细胞内突变型p53基因，被野生型所取代。Clarke LE等首先公布了在NSCLC患者中进行的反转录病毒p53 基因的替代治疗，证明了这种治疗的安全性;同时也观察到了p53的表达、肿瘤的凋亡及退缩。随后，相继报告了腺病毒作为载体的安全性及疗效，载体相关反应是轻微的。

以p53为靶点的肿瘤基因治疗临床前研究表明，腺病毒转染p53 基因，能抑制小鼠肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，与化疗药物顺铂合用能增加疗效，而且不影响成纤维细胞的生长。在肺癌和头颈部肿瘤有抗瘤活性。Weill对12例气道堵塞而无法手术的肺癌患者，进行支气管镜下瘤内注射rAd-p53,每次剂量为(1x106) ~ (1x109) pfu, 28天注射1次，6例患者气道堵塞的症状缓解，3例患者的肿瘤达到部分缓解。但rAd-p53,也存在一些疗效欠佳的报道，临床试验结果难以令人满意，究其原因可能与p53基因不能在靶细胞内足量表达有关。

4.SurvMn

属于凋亡抑制蛋白(IAP)基因家族中的新成员，与其他抑制蛋白(IAP)基因家族的成员相比，其羟基末端缺少直接与caspase23 结合的环指结构，且在多数肿瘤组织中高表达;但不表达于终末分化组织。该基因在癌组织的表达率达72%,且具有抗细胞凋亡和促进细胞增殖的双重作用。Survivin反义寡核苷酸(ASODN)能有效抑制肺癌细胞株NCI2H446 Survivin mRNA和蛋白的表达，并诱导凋亡， 抑制细胞生长。Ras基因是肺癌治疗极为重要的靶分子，且其是控制正常细胞向癌细胞演变过程的重要靶点。已知Ras基因经蛋白质活化, 促进Ras基因与细胞膜接触，从而参与细胞生长信号传播途径。据此原理，人们已设计系列法尼基抑制剂(FTIs),拟通过对该转移酶的抑制，起到阻断Ras基因的活化，从而最终抑制癌细胞生长。尽管该类药物其中包括lonafarnib及tipifarnib等，已分别进入临床II期试验;但对其毒副作用及临床上的疗效，还有待于验证。

5.Sp1

是一个普遍存在于哺乳动物细胞中的转录因子，在保证持家基因、组织特异性表达基因及病毒基因正确表达过程中起重要作用。Sp1特异性的结合启动子区的GC/GT盒，激活有关TopoII基因在内的有关基因转录。对于含多个Sp结合位点的启动子，Sp1通过直接的蛋白质2蛋白质相互作用，发挥协同转录功能。已有研究证实，在Topo II α的启动子区包含了2个GC盒，Sp1通过3个锌指结构与TopoIIa启动子区的GC/GT盒，上调TopoII的表达。通过TopoIIa基因转染，提高TopoIIa水平，可使肿瘤细胞对Vp216敏感性增加，从而达到对小细胞肺癌耐药细胞的化疗增敏作用。

结语：肺癌的基因治疗总体上还处于起步阶段，大部分还处于初创或临床I期试验阶段，成功应用于临床尚需大量的工作。亟待解决的问题主要为以下几方面：①组织和细胞的特异性，其关系到提高基因治疗的杀伤效率、减轻毒副作用的关键性问题，尽管已经有了初步成功，但离真正解决临床问题还有待进一步研究和完善。②理想载体的选择问题。目前在构建靶向性基因转移的载体方面与理想载体还有很大差距。③载体的安全性问题。④目的基因表达水平的控制问题。目的基因在靶细胞内如何适度表达，还是个难以解决的问题。⑤体内转导的成功率低、靶向性较差。⑥单一基因治疗的有效率尚有待提高。 ⑦肿瘤耐药性以及肿瘤内部用药对远处转移灶无效。目前还存在缺少高效传递系统、缺少稳定持续表达以及易产生宿主免疫反应等诸多问题。但有理由相信，随着基础研究的深入，将出现更多的、更为有效的基因治疗靶位和治疗方式;随着大量临床试验的进行，将会出现较为固定和常规的基因治疗模式和方法，成为可供医生选择的治疗手段。由基因治疗自身的靶向性好、可操控等特点，可以预见其将有较好的应用前景。同时，随着基因诊断等其他新兴技术的临床应用的普及，将最终实现肺癌患者的基因组水平的个性化诊断。根据诊断结果, 将可以实现肺癌的个性化、多靶位的基因治疗，完成对患者手术前肺癌的生长转移控制，术后恢复期的持续治疗最终将大大提高肺癌患者的5年存活率。基因治疗必将成为肺癌治疗的重要工具，最终将造福广大肺癌患者。