关于NGS在肿瘤临床诊疗中的作用

精准医学(PrecisionMedicine)是以基因组信息为基础，根据患者的临床信息和人群队列信息、应用现代遗传技术、分子影像技术、分子病理学及生物信息等技术，结合患者的生活环境和方式，实现精准的疾病分类及诊断，制定具有个性化的疾病预防和治疗方案。精准医学的主要切入口是肿瘤精准诊疗，而二代测序技术(Nextgeneration sequencing,NGS)是目前读取人类疾病尤其是肿瘤性疾病基因组信息的重要技术平台，其在临床肿瘤尤其是难治性肿瘤精准诊疗中发挥重要作用已是不争的事实，目前面临的挑战主要是如何使用好这个新的技术服务临床?如何正确解读NGS技术平台所产生的结果?

虽然NGS在肿瘤临床精准诊疗应用中涉及很多尚未解决的问题，但最基本的问题主要是以下几个方面，这些关键环节将直接影响NGS的结果及其应用。

1、检测前的专业咨询：主要弄清楚该不该做NGS?检测目的是什么(是为了解决用药或治疗反应或预后判断)?检测哪些基因?如何检测?拿到结果后如何再解读等等?

所谓专业咨询，即患者在检测前需要寻求既了解临床肿瘤学、病理和分子病理学、分子肿瘤学知识，又懂得分子遗传学、基因组学和简单生物信息学等跨学科知识的专家或专家团队(MDT)帮助。在明确肿瘤性质、病变特点、临床分期等基础上选择合适的样本与检测产品。产品选择时需要根据患者肿瘤特征，确认产品基因列表中能覆盖热点驱动基因或特殊变异形式(如特殊的融合)，

一般而言，晚期癌症患者可以进行NGS大panel检测，这样的检测信息至少可以帮助明确药物靶点、免疫治疗相关标志物(如目前的TMB、MSI等)、基因群及其信号网络对化疗的可能影响(不是简单一对一关系)、复发与预后信息的大概预测(如癌干细胞克隆富集和表观遗传学改变)等等。

WES或RNA-seq或全基因组(WGS)检测一般是在大panel不能完成或驱动基因较分散且不固定的癌种如三阴性乳腺癌(TNBC)可以使用，因为WES以上的测序生信分析与临床解读极为困难，不是一般医生或公司解读人员能完成好。

应用NGS进行肿瘤新抗原预测时，一般采用新鲜组织做WES测序及表位预测，然后经过RNA-seq验证。以目前的石蜡切片的大panel检测或WES来预测一般不准确。一是石蜡样本DNA质量上不能完全满足精细的抗原预测，二是基因变异需要得到正确表达才可能成为抗原，同时有些抗原是来自融合蛋白，这些都需要在RNA水平确认。

2、检测前样本病理质控：这是不可缺少的重要环节，在手术离体样本正确处理前提下，做好样本质控主要包括：(1)组织蜡块的正确选择，确保蜡块组织中至少包括20%以上的癌细胞，避开出血与坏死区域;但对于穿刺小标本，至少要保证含200个细胞以上。为保证NGS检测结果可靠性，切忌拿不经过病理确认的标本做基因检测，那样会增加检测风险和成本。(2)切片过程中防止人为污染，使用一次性新刀片切片，贴片池的水亦需要更换新鲜水。

一般而言，首次做基因检测的患者，能用组织检测的都优先考虑组织检测;实在拿不到组织情况下，可以考虑血液或其它与癌相关的体液检测，但对于治疗反应监测可以用血液检测，血液检测要以EDTA抗凝管抽血。

对于胸腹水样本，亦可以通过离心富集癌细胞做成细胞蜡块后再切片送检。对于特殊肿瘤组织如像本案例那样包含很多黏液湖的黏液癌或弥漫分布的癌细胞的组织，在检测前需要进行癌细胞富集(人工或激光显微捕获等)。

3、检测中的质控：这部分工作是患者和医生都无法把控的环节，需要各检测单位严格按照国际和国家规范进行检测，做好检测全流程质控如各种试剂质控、样本病理再质控、DNA提取质控(含量、质量和完整性)、文库构建质控、上机测序质控、对照样本质控、数据下机后质控、生信处理标准与质控、报告规范性等等。

这些步骤严格质控的目的主要是确保真正的驱动基因不被忽略掉。报告形式与内容上要充分体现重点变异信息突出、基本信息完整正确、驱动变异识别正确、用药推荐合理等。总体上要做到重点突出、简明易读，并方便医生与患者检索信息。避免主次不分、添枝加叶干扰阅读。

4、NGS检测报告临床解读：可以说，NGS检测报告的临床再解读是实现NGS检测临床价值最关键的一步!很多人会问，检测公司报告都写得很清楚了，为什么还要重新解读报告?事实上，除了简单的癌基因如EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1、MET、HER2等常见的癌基因和常见的抑癌基因如TP53、PTEN、APC、STK11、RB、CDKN2A等容易被检测公司识别和解读外，其他类型突变的基因群如表观遗传学驱动等及其相关信号网络驱动作用的信息，几乎被检测公司忽略掉，这也反映了检测公司不能正确识别驱动基因，这样就难以准确推荐药物了，更谈不上形成可行的治疗方案。

另外，在已知的驱动突变基因中，备选药物常常多种，但到底是先用哪个药，报告里一般不能明确。再者，目前几乎所有的NGS报告对关键驱动基因变异的解读亦仅仅是罗列信息，未能提供信息之间的关联分析和可靠结论。

因此，拿到NGS报告后需要重新梳理报告中驱动基因是否判读准确?用药推荐是否合理?意义未明的基因是否是真正的意义未明或起到关键驱动作用?要综合分析基因群变异及其信号网络是否对当前常规化疗方案产生的可能影响，是否存在耐药复发的可能种子?用药的先后顺序如何安排等等?只有这样的临床再解读，NGS检测报告才能实现它的真正价值，NGS技术才能真正助力价值医疗。

转自邱立新医生微信公众号